Formation indépendante de la marque de matériel HPLC utilisé par le stagiaire.

Durée : 3,5 jours

Connaissances requises

• notions élémentaires de chimie (pression, débit, température, volume, concentration, dilution, pH, pKa, polarité, caractère hydrophile/hydrophobe, …)
• au moins 3 mois de pratique régulière de la chromatographie en phase liquide
  

Programme du cours

Instrumentation

• constituants d’un système HPLC
• principe de fonctionnement, rôle et intérêt des dégazeurs, pompes, injecteurs,enceintes colonnes, détecteurs (UV 2D, UV 3D, Fluo, RI, DEDL)

Colonnes

• principe général de la séparation et notion de mode chromatographique
• principe de la séparation en phase normale ou phase inverse et intérêt du recul d’ionisation et de l’appariement d’ions

Modes d'élution

• isocratique (principe, avantages/inconvénients)
• gradient (principe, avantages/inconvénients, démarche d'optimisation)

Exploitation des données

• principe de l’intégration
• principe de l’étalonnage externe / interne

Qualité de la séparation chromatographique

• grandeurs fondamentales k’, a, N, HEPT, R
• dispersion et diagramme de Van Deemter

Précautions d'usage

• préparation des échantillons et phases mobiles, choix des tubulures et raccords
• installation et précautions d'utilisation de la colonne, démarrage et arrêt du système

Problèmes courants et causes principales

• problèmes de pression, bruit de fond anormal ou dérive du signal
• apparition de pics parasites, déformation des pics
• problèmes de TR et/ou de surfaces

Programme des ateliers

Travaux Pratiques n°1

• examen du circuit fluidique d’un système HPLC depuis la crépine jusqu’à la sortie détecteur et identification des éléments traversés.
• injections successives d’un échantillon dans différentes conditions en mode phase inverse.
• analyse collégiale des résultats et mise en évidence :
  • du rôle et de l’influence de la polarité de la phase mobile
  • de la relation entre conditions d’analyse (colonne / phase mobile) et qualité de la séparation (grandeurs fondamentales)
  • de l’effet du débit sur les TR, les surfaces et les grandeurs fondamentales
  • de la notion de sélectivité liée à la colonne

Travaux Dirigés

Série d'exercices permettant de réviser certains points vus en cours aux chapitres Instrumentation / Colonnes / Modes d’élution / Qualité de la Séparation.

Travaux Pratiques n°2

Une dizaine de problèmes est passée en revue de la façon suivante :

• sur un système HPLC fonctionnant normalement, les stagiaires injectent un échantillon pour obtenir un chromatogramme de référence.
• à leur insu, le formateur crée un problème.
• les stagiaires injectent à nouveau, observent une anomalie puis, par groupes de 2 ou 3, essaient de déterminer l’origine du problème.
• la correction est réalisée collégialement.